光合作用是地球上最重要的生物化學過程之一，它將光能轉化為化學能，為幾乎所有生命提供能量和有機物質。這一過程分為光反應和暗反應兩個階段。光反應階段直接在光下進行，而暗反應階段傳統上被認為可以在黑暗中進行，但科學家們通過深入研究，特別是對暗反應中各個步驟的細致分析，揭示了暗反應并非完全獨立于光，其中部分反應間接依賴于光反應提供的能量和還原力。

暗反應，又稱卡爾文循環，主要包括三個關鍵步驟：羧化、還原和再生。其核心過程可簡述為：核酮糖-1,5-二磷酸（RuBP，即C5）與二氧化碳（CO?）結合，在RuBP羧化酶/加氧酶（Rubisco）的催化下，生成不穩定的六碳中間體，隨即分解成兩分子的3-磷酸甘油酸（3-PGA，即C3）。3-PGA在一系列酶的作用下，利用光反應產生的ATP和NADPH，被還原并轉化為三碳糖（如甘油醛-3-磷酸，G3P）。一部分G3P被輸出用于合成葡萄糖等糖類，另一部分G3P則經過復雜的再生過程，重新生成RuBP（C5），以維持循環的持續進行。

為精確確定暗反應階段中哪個具體反應間接依賴于光，科學家們設計了巧妙的實驗。其中，利用單細胞綠藻——小球藻（Chlorella）進行的實驗具有里程碑意義。小球藻光合作用效率高，易于在受控條件下培養和進行生化分析，是研究光合作用的理想模式生物。

在經典實驗中，科學家首先讓小球藻在光照下進行充分的光合作用，使其細胞內積累充足的光反應產物（ATP和NADPH）。將小球藻迅速轉移到黑暗環境中，并供應帶有放射性同位素標記的1?CO?。通過追蹤1?C在暗期間各種中間產物（如3-PGA、G3P、RuBP等）中出現的時間和順序，可以推斷反應的進程。

實驗結果清晰地表明：在黑暗初期，1?CO?仍然能夠被固定，并迅速出現在3-PGA中，這說明RuBP與CO?結合的羧化反應本身（即C5 + CO? → 2C3）在黑暗中可以短暫進行，只要存在預先由光反應生成的RuBP。實驗也發現，如果沒有持續的光照，1?C標記很快停滯在3-PGA階段，無法進一步向G3P和糖類轉化，同時RuBP（C5）的再生也迅速停止，導致整個循環中斷。

這一關鍵發現揭示了暗反應對光的間接依賴性主要體現在兩個后續步驟：

1. 還原階段：3-PGA還原生成G3P的反應，直接需要消耗光反應提供的ATP和NADPH。一旦黑暗中沒有新的ATP和NADPH生成，即使有CO?固定，還原反應也無法進行。
2. 再生階段：由G3P重新生成RuBP（C5）的過程，同樣需要消耗大量的ATP。沒有持續的光反應供應ATP，RuBP庫將耗盡，羧化反應也會因缺乏底物而停止。

因此，科學家得出結論：在光合作用的暗反應（卡爾文循環）中，C3（3-PGA）經一系列變化生成糖類和重新生成C5（RuBP）的過程，是間接依賴光的。這種依賴性并非對光本身的直接需求，而是對光反應產物——ATP和NADPH的依賴。而C5與CO?結合生成C3的初始羧化反應，在短時間內可以不直接需要光能，但長期來看，其持續進行也依賴于光能驅動的再生步驟來提供底物C5。

這項利用小球藻的實驗不僅闡明了暗反應的能量依賴本質，也深化了我們對光合作用兩個階段緊密耦合、協同工作的理解。它表明，將光合作用簡單地劃分為“需光”和“不需光”的階段是一種簡化，實際上暗反應是光反應在代謝上的延續，共同構成一個完整、高效的能量轉化系統。